2.确定扫描方式：点、线、面、三维扫描(面扫描和线扫描)(平面扫描是什么情况)

一 激光共聚焦显微镜样品制备

激光共聚焦显微镜的样品制备是检测前的关键步骤。样品需要用荧光探针标记。

标本可以是固定或活组织，或固定或活贴壁培养。细胞应在共聚焦特殊培养皿或盖玻片、悬浮细胞、萼片或滴剂以及盖玻片上培养并覆盖。

样品的最大厚度应在1~2mm左右，盖玻璃厚度应小于0.17mm，滑块厚度应在0.8~1.2mm之间，表面应光滑，厚度应均匀，对荧光无明显干扰。固定样品通常用密封片密封，并且通常用在pH 8.5-9下使用PBS制备的甘油密封。

二 常规样品制备要求

1.染料的选择

由于激光共焦显微镜使用单波长激光器作为光源，因此荧光染料的选择应基于激光共焦显微显微镜的激光波长。

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2.样品载体的选择

普通共焦显微镜的高倍物镜是油透镜。数值孔径小，透镜与样品之间的工作距离不超过0.17mm。因此，如果观察样品是贴壁细胞或组织切片，则可以使用正常载荷。

载玻片和盖玻片都可以。如果是悬浮细胞或悬浮颗粒，可以将样品放在激光共聚焦显微镜专用的培养皿中进行观察。

3.密封片的选择

如果样品只需观察一次，且荧光不易熄灭，则可使用一定浓度的甘油混合物密封薄膜。如果样品需要放置一段时间并且需要多次使用，则应使用抗荧光猝灭密封件以减少荧光信号的损失。

三 激光共聚焦显微镜的操作步骤

1.根据荧光探针的激发和发射波长，选择合适的激光器、激光功率、光谱滤波器和发射滤波器。

2.确定扫描方式：点、线、面、三维扫描。

3.确定扫描密度：256×256512×5121024×10242048×2048，分辨率越高，扫描速度越慢，图像信噪比越好，但可能发生的光漂白越多。

4.选择共焦显微镜物镜的放大倍率和电子放大倍率：确定此条件后，确定扫描范围。物镜的透射率与数值孔径的四次方和物镜放大倍数的平方成比例。因此，应尽可能选择高数值孔径的物镜。

5.根据样品的制备质量，选择合适的针孔尺寸，调整激光管的电压、光电倍增管的功率和降噪，以达到最佳状态。这些参数的选择或设置非常严格，应综合考虑。

⒍ 确定光切割范围，即扫描样本的厚度、开始位置和结束位置。

⒎ 显示了光线切割的层数和拍摄期间的累积平均次数。

8.获取并保存图像。